Problema 1: Sinal elevado.
Um elevado sinal em ensaio de ELISA pode decorrer de vários motivos, incluindo: anticorpo conjugado muito concentrado, pouca lavagem da placa ou ainda muito tempo de reação. Um sinal elevado pode gerar precipitação do reagente colorimétrico ao final da reação que resulta em variabilidade do sinal, gerando resultados incorretos. Ainda, um sinal muito elevado (DO650nm >3) resulta em leitura no equipamento fora da faixa de linearidade, o que resulta em dados imprecisos. Geração de resultado falso positivo também é uma possibilidade quando houver um sinal
muito elevado.
POSSÍVEIS SOLUÇÕES PROBLEMA 1:
1. Aumentar a lavagem da placa (faça um maior número de etapas de lavagem e/ou aumente o volume de cada lavagem, garanta a agitação da placa durante a lavagem ou ainda aumente o tempo de cada etapa de lavagem).
2. Diminuição do tempo de incubação com o cromógeno (diminua o tempo de incubação com o reagente colorimétrico (TMB), ou seja, pare a reação antes, para garantir que as leituras não ficarão tão elevadas.
3. Diminuição da concentração do anticorpo conjugado (avalie diferentes concentrações do anticorpo conjugado e escolha aquela que apresente um sinal adequado).
4. Verifique se a solução de cromógeno TMB não está contaminada. O reagente deve ser incolor. Caso tenha aparência azulada, pode estar contaminado com peroxidase, inviabilizando sua utilização. Para evitar este problema, nunca insira pipetas ou outros objetos dentro do frasco do reagente, sempre inverta um pouco em frasco limpo para pipetá-lo e descarte o volume que não foi utilizado. Outra dica importante é que o reagente é sensível à luz e não deve ser muito manipulado em condições de muita iluminação laboratorial.
5. Aumente a concentração de sal nos tampões. Concentrações salinas crescentes podem reduzir interações não-específicas, melhorando a especificidade do sinal.
6. Cuide sempre para que o volume de bloqueio seja superior aos volumes das outras etapas do ensaio. Isso garante que não haja ligação de anticorpos primários ou secundários diretamente com porções dos poços que não tenham sido devidamente bloqueadas.
Problema 2: Sinal de fundo (background) elevado.
Sinal de fundo elevado é prejudicial para correta análise do ensaio, levando muitas vezes a ocorrência de resultados falso-positivos.
POSSÍVEIS SOLUÇÕES PROBLEMA 2:
Problema 3: Duplicatas com variação.
Alta variação de sinal entre amostras pode ser devido a erros na preparação da amostra, erros de pipetagem e outras inconsistências durante a técnica, como agitação insuficiente ou lavagem heterogênea da placa. Dados com alta variação podem distorcer os resultados reais e causar inconsistências na análise de dados.
POSSÍVEIS SOLUÇÕES PROBLEMA 3:
1. Melhoria da pipetagem. Calibre as pipetas rotineiramente para diminuir erro associado a pipetagem, certifique-se que as ponteiras estão bem inseridas e que liberam todo volume coletado a cada pipetagem.
2. Melhoria da lavagem- Certifique-se que a lavagem dos poços está sendo adequada e homogênea, assegure-se que o volume de lavagem seja completamente aspirado em cada etapa.
3. Homogeneização correta das amostras. Homogenize bem as amostras antes de pipetar.
4. Garantia de agitação suficiente da placa em todas as etapas.
5. Certifique-se que todas as amostras estão na mesma temperatura. Temperaturas heterogêneas em qualquer passo da técnica gera resultados discrepantes.
6. Não empilhe placas. Placas empilhadas não permitem distribuição uniforme da temperatura em todos os poços.
7. Certifique-se da ausência de bolhas nos poços antes da leitura. As bolhas interferem na leitura da placa.
8. Evite contato direto da ponteira da pipeta com o fundo do poço. Isso pode interferir nas moléculas sensibilizadas no fundo da placa e interferir
no resultado.
Problema 4: Ausência de sinal
Nenhum sinal no seu ensaio ELISA pode resultar de numerosos problemas de amostra e ensaio, incluindo tampão de lavagem contendo azida, alvo abaixo da detecção do ensaio entre outros motivos.
POSSÍVEIS SOLUÇÕES PROBLEMA 4:
1. Verificar atividade dos reagentes utilizados. Certifique-se de que osanticorpos, conjugados e substrato estejam funcionais.
2. Assegure-se que a solução de imobilização não contém agentes de bloqueio, nem detergentes. Esses componentes impedem a correta imobilização do alvo na placa.
3. Verifique se o tampão de lavagem contém azida. Azida inibe a atividade da HRP. Caso o tampão de lavagem contenha azida, resquícios destecomposto nos poços pode inibir a reação colorimétrica com o substrato TMB.
4. Otimize o tempo de incubação das etapas. Talvez o tempo de incubação esteja muito curto. Varie o tempo de incubação de cada etapa e verifique qual tempo de reação é mais adequado para gerar o melhor sinal-ruído.
5. Uma possibilidade para a ausência de sinal é se o alvo sensibilizado na placa perdeu conformação e não está sendo reconhecido pelo anticorpo.
Uma opção seria utilizar placas sensibilizadas com estreptavidina e incubar o antígeno biotinilado na placa. Esta estratégia evita a adsorção direta da proteína na placa evitando possíveis distorções em sua estrutura tridimensional.
